«Pendant des siècles, la Médecine s’est préoccupée de soigner. Aujourd’hui elle s'est donnée comme but de prévenir plutôt que de guérir.»
Pr Jean Dausset, Prix Nobel de Médecine, 1980
La Fondation Jean Dausset - Centre d’Etude du Polymorphisme Humain participe aux efforts nationaux et internationaux de recherche pour mieux déterminer le rôle du polymorphisme génétique chez l’Homme, tout particulièrement dans les maladies complexes, pour mieux les comprendre, les diagnostiquer et participer au développement d’une médecine personnalisée.
Présentation Principales collections Activités Réseau Valorisation

Le 1er CRB français certifié ISO20387


Le CEPH est fier d'annoncer que son Centre de Ressources Biologiques (CRB) est devenu, le 12 mars 2020, le 1er CRB français certifié ISO20387 : 2018 pour ses activités de collecte, réception, traitement, conservation, mise à disposition de ressources biologiques d'origine humaine en collaboration ou en prestation. Le CRB a simultanément obtenu le renouvellement de sa certification ISO 9001 : 2015 (Systèmes de Management de la Qualité - Exigences).

L'obtention de cette certification cette nouvelle norme internationale ISO20387 : 2018 (Biotechnologie « Biobanking » - Exigences générales relatives au « biobanking »). permet au CRB de se positionner en tant qu'acteur majeur dans le réseau des biobanques nationales et internationales et au premier plan dans le cadre des projets à grande échelle de la médecine génomique future comme le Plan France Médecine Génomique 2025 (PFMG2025).

La norme internationale des CRB : ISO20387 vise à permettre aux biobanques de démontrer qu'elles font preuve de compétence et qu'elles sont en mesure de fournir des matériels biologiques et des données associées de qualité appropriées pour la recherche et le développement.

Elle vise aussi à garantir que les échantillons sont traités selon un même niveau d'exigence dans le monde entier pour favoriser des collaborations internationales.

Le CRB du CEPH est le quatrième laboratoire dans le monde à obtenir cette nouvelle certification internationale après la Cornell Veterinary Biobank aux Etats-Unis, la Beijing Stem Cell Bank at the Institute of Zoology en Chine et la Biobanque de l'Institute of Bio-Stem Cell Rehabilitation en Ukraine.

Ce succès récompense une vision et des années d'investissement du CEPH et de son CRB vers l'excellence des projets qu'il mène.

Le CRB du CEPH 3.0



Le Centre de Ressources Biologiques du CEPH (CRB du CEPH) a réorganisé intégralement sa chaîne de traitement des échantillons pour répondre aux demandes de grands projets ambitieux comme MyPeBS (My Personal Breast Screening) et potentiellement à d'autres projets d'ampleur nationale ou internationale. Pour cela une réflexion stratégique sur la réorganisation de ses activités, impliquant l'ensemble du personnel a été menée, de manière à anticiper et pallier les difficultés.


Dès 2018, le CRB du CEPH intègre le projet MyPeBS, en tant que partenaire et s'engage à réaliser les extractions d'ADN de 42500 prélèvements salivaires en 2 ans ½ mais également les quantifications, normalisations, contrôles de qualité, aliquotage, stockage et mise à disposition des échantillons d'ADN.


Pour réaliser ce projet, le CRB du CEPH a multiplié par quatre sa capacité d'extraction en adaptant l'organisation du laboratoire tout en garantissant la traçabilité des échantillons, en assurant la qualité des échantillons dans les délais imposés et en limitant les coûts de traitement.


Les changements ont porté principalement sur les éléments suivants :

  • La base de données Biobase a été profondément modifiée pour simplifier chaque étape de traçabilité tout en maintenant ou augmentant la traçabilité des échantillons.
  • Les extractions d'ADN ont été optimisées sur un extracteur automatisé Chemagic™Prime™ (PerkinElmer) utilisant des billes magnétiques.
  • Un protocole a été adapté pour les extractions d'ADN de kits salivaires type (OG-600 ou OG500 DNA-Genotek) pour éviter les contaminations liées à la viscosité des échantillons, éliminer complètement les billes magnétiques et garantir un rendement en ADN optimisé.
  • Les pipetages (normalisation des concentrations, aliquotage, distribution en microplaques) ont été automatisés sur le Chemagic™Prime™ (PerkinElmer).
  • Les contrôles de qualité ont été semi-automatisés sur un Fragment Analyzer (Agilent) pour établir un score de qualité reflétant la taille de l'ADN et son intégrité.
  • Les tubes tricodés (FluidX) ont été sélectionnés comme contenants de stockage de l'ADN avec les scanners et les capper/decapper adaptés.
  • Le CRB s'est également équipé également d'un QuantStudio3™ (Thermo) pour réaliser du génotypage SNP à moyen débit.
  • L'ensemble de l'organisation permettant de garantir la traçabilité des échantillons a été revue et adaptée.

Cette nouvelle organisation, mise en place en 15 mois, est validée sur les échantillons reçus dans le cadre du projet MyPeBS depuis l'été 2019. Elle a pu être menée à bien grâce à un travail collectif impliquant toute l'équipe, un renforcement de la polyvalence du personnel et la suppression de tâches répétitives.

Ces changements ont également permis au CRB d'être sélectionnés dans le cadre du projet POPGEN : pilote du projet de population générale du Plan de Médecine Génomique de l'INSERM (PMG2025) et confirment le dynamisme du Système de Management de la Qualité du CRB du CEPH.


Présentation des activités du CRB


Le CRB du CEPH a été certifié conformément aux normes ISO9001 : 2015 et ISO20387: 2018, le 12 mars 2020, pour ses activités de collecte, réception, traitement, conservation, mise à disposition de ressources biologiques d'origine humaine en collaboration ou en prestation.

Le CRB du CEPH avait précédemment été certifié conformément aux normes ISO9001 : 2015 et NF S96-900, le 31 mars 2017, pour ses activités de réception, traitement, conservation, mise à disposition de ressources biologiques d'origine humaine.

La biobanque du CEPH est un Centre de Ressources Biologiques (CRB) à grande échelle qui reçoit des prélèvements humains, sangs frais ou congelés, tissus, culots cellulaires, sérums ou plasmas, lignées cellulaires, prélèvements buccaux ou ADN afin de stocker et/ou transformer les matériels biologiques, en vue de projets de recherche et de distribution immédiate ou ultérieure aux collaborateurs.

Plusieurs dizaines de milliers d’échantillons sont reçus chaque année dans le cadre de nombreux programmes. Le nombre de prélèvements à traiter, et la diversité des projets de recherche pour lesquels les échantillons sont pris en charge, nécessitent une expertise technologique et une grande standardisation. Une validation technique des protocoles, associée à l’utilisation d’une base de données développée et adaptée à l’activité, ainsi que des procédures d’assurance qualité, mises en place depuis la réception des échantillons biologiques jusqu’à l’envoi des échantillons transformés aux centres demandeurs, garantissent la traçabilité, la reproductibilité et une bonne qualité des matériels biologiques. Le manuel qualité du CRB est disponible sur demande auprès du .


Les principales collections


Le CRB conserve, maintient et distribue à la communauté scientifique internationale les ADN :

Par ailleurs, le CEPH a constitué dans les années 1990-2000 une collection française de prélèvements biologiques (ADN, cellules, plasma) de personnes très âgées : nonagénaires et leurs enfants appartenant à des fratries, et centenaires non apparentés. Le CRB héberge également les ADN du programme européen GEHA (Genetics of Healthy Aging) dans lequel il a été partenaire.

Le CRB met en place des collections en collaboration avec des équipes de recherche en proposant aux investigateurs son support logistique.

Les prélèvements d’une cohorte de plusieurs milliers d’échantillons collectés dans le cadre d’un essai clinique mené par l’INCa sur le cancer du sein, SIGNAL, ont ainsi été traités et sont conservés dans le CRB.

Le CRB a assuré la préparation des échantillons biologiques testés dans le programme européen CAGEKID (CAncer GEnomics of KIDney).

Le CRB est impliqué dans la mise en place de la collection d’échantillons biologiques de l’étude COBLAnCE financée dans le cadre des « Investissements d’Avenir ».

Le CRB est responsable de l'extraction des ADN du projet MyPEBS (My PErsonal Breast Screening) financé par l'Union Euroéenne dans le cadre du programme d'innovation et de recherche Horizon H2020 (N° 755394).

Le CRB a été sélectionné par l'INSERM, pour réaliser la collecte et le traitement des échantillons biologiques du projet « Population générale » (POPGEN) un des quatre projets pilotes mis en oeuvre dans le cadre du Plan France Médecine Génomique 2025 (PFMG 2025).

Le CRB s'est réorganisé en 2018-2019 pour répondre aux besoins de programmes nationaux et internationaux comme les projets MyPeBS et POPGEN en renforçant l'automatisation de la réception des prélèvements, des extractions d'ADN, des aliquotages et des contrôles de qualité.

Le CRB héberge depuis 2020 les prélèvements salivaires des collections E3N et E4N.

Le CRB du CEPH a été sélectionné pour être le CRB du projet pilote SAPRIS-SERO (Santé, Perception, Pratiques, Relations et Inégalités sociales en population générale pendant la crise COVID-19 - Sérologie).
Cette étude vise a:
1) à quantifier et suivre l'incidence cumulée de l'infection à SARS-Cov2 dans la population française à l'aide de tests sérologiques
2) en étudier les déterminants à partir des cohortes Constances, E3N-E4N, ELFE-Epipage 2 et NutriNet Santé.

Visualiser le catalogue des échantillons biologiques conservés dans le CRB, classés par thématique.

Les activités du CRB


Le CRB travaille, à chaque étape du processus, en étroite collaboration avec le coordinateur de l’étude, de manière à mettre en place des collections de matériels biologiques de qualité associés à des données fiables et à permettre des analyses ultérieures pertinentes.

La constitution de collections
Le CRB peut proposer une organisation permettant l'inclusion de volontaires dans un projet de recherche. Une base de données dédiée à la collecte et permettant de garantir la traçabilité de celle-ci peut être adaptée aux besoins des collaborateurs.

La réception des échantillons
Le CRB reçoit des prélèvements transportés de manière à conserver l’intégrité des matériels biologiques en utilisant des conditionnements et moyens de transport conformes à la réglementation internationale en vigueur. Chaque prélèvement réceptionné est contrôlé puis enregistré dans la base de données du CRB.


Les transformations des matériels biologiques
Toutes les opérations de transformation d’un échantillon biologique en produits dérivés sont enregistrées dans la base de données du CRB. Chaque matériel transformé fait l’objet d’une nouvelle identification, ce qui permet une traçabilité de l’arborescence et du mode de fabrication des échantillons. L’utilisation de lecteurs de codes à barres dans les manipulations permet de limiter au maximum les risques d’erreurs.

L’isolement des lymphocytes du sang périphérique est réalisé sur gradient de densité en ficoll en vue d’une immortalisation ultérieure par infection des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr. Des culots lymphocytaires de plusieurs dizaines de millions de cellules peuvent ensuite être produits en vue de l’extraction ultérieure d’ADN, d’ARN ou de protéines.

Les ADN sont isolés sur des automates Chemagic ™ Prime ™ (PerkinElmer) permettant leur extraction à partir de sang frais ou congelé, de salive, de tissus congelés ou de culots lymphocytaires, en utilisant la méthode des billes magnétiques. Les ADN sont quantifiés en fluorimétrie et dilués pour obtenir une concentration normalisée.

Les ARN sont extraits de manière semi-automatisée à partir de tissu ou de sang PAXgene congelés par passage sur une membrane de silice. Les ARN sont quantifiés en spectrophotométrie.



Les contrôles de qualité
Un contrôle systématique, de la non-contamination par des mycoplasmes, des lignées conservées ou transmises par des laboratoires extérieurs est réalisé lors de chaque décongelation en vue d’une expansion cellulaire.

Des contrôles de qualité sont réalisés sur environ 20% des ADN traités dans le CRB sur un Fragment Analyzer (Agilent):
- intégrité de l'ADN,
- contrôle du caractère amplifiable de l'ADN et du genre ainsi que la vérification de la correspondance avec les données transmises.
Un contrôle de l’authenticité de l’échantillon peut également être réalisé.

La qualité des ARN est évaluée par mesure du RIN (RNA Integrity Number).

Le génotypage SNP
Le CRB réalise le génotypage de marqueurs de type SNP (Single Nucleotide Polymorphisme) en plaque 96 puits sur un QuantStudio3TM (AppliedBiosystems).

Le stockage
Les échantillons biologiques sont conservés :
- dans des congélateurs à -80°C pour les tissus, plasma, sérum, ARN et ADN, sangs en attente d’extraction,
- dans l’azote liquide à -196°C pour les fractions lymphocytaires et lignées cellulaires viables,
- à température ambiante pour les prélèvements de salive stabilisés.

Afin de renforcer la sécurité des matériels biologiques (ADN, PBL ou lignées), ceux-ci sont, dans la mesure du possible, aliquotés en au moins deux tubes et conservés dans deux enceintes réfrigérées distinctes.

Un système automatisé de contrôle et d’enregistrement continu des températures permet la surveillance de tous les équipements de conservation du CRB (température ambiante, 4°C, -20°C, -80°C, -196°C, incubateurs à CO2). En cas de problèmes de température, ce système sécurisé est couplé à une alarme qui engendre une intervention immédiate.

Les échantillons sont conservés dans des pièces dédiées d'accès restreint. Dans le cas où un dysfonctionnement interviendrait dans un des congélateurs, un équipement de secours, en fonctionnement, localisé dans cette même pièce, est utilisé pour sauvegarder les échantillons.
Les cryo-conservateurs de grande taille (15.000-30.000 tubes cryogéniques par conteneur) sont automatiquement alimentés en azote à partir d’un réservoir central et contrôlés par télésurveillance.

Le CRB conserve dans :

  • ses congélateurs à -80°C: environ 232.000 tubes d’ADN, de plasma et de sérum,
  • ses cryoconservateurs à -196°C environ 85.000 ampoules de cellules viables : lignées lymphoblastoïdes et lymphocytes.


La mise à disposition des échantillons
Les matériels biologiques sont distribués conformément à la politique définie dans le cadre de chaque projet et à la réglementation en vigueur. Les envois sont réalisés en respectant les conditions de température appropriées au matériel biologique.

Le réseau du CRB

Le CRB collabore tout particulièrement avec :

  • l'AP/HP,
  • le CNRGH-IG-CEA (Centre National de Recherche en Génomique Humaine)
  • la Fondation Synergie Lyon Cancer
  • l’IFCT (Intergroupe Francophone de Cancérologie Thoracique),
  • l’INCa (Institut National du Cancer)
  • l'INSERM
  • l’Institut Gustave Roussy
  • l’Institut régional du Cancer Montpellier / Val d’Aurelle,
  • UNICANCER

Le CRB participe aux réseaux :

Contacter le Responsable du CRB .


Valorisation des collections

Le projet PHARE / SIGNAL / SIGNAL-ICGC, un exemple de collaboration réussie

La bonne communication entre les différents acteurs ainsi que la collaboration fructueuse et efficace entre les différents partenaires en charge de la collection, du traitement des échantillons, du génotypage et des analyses génétiques ont permis d'obtenir une collection d'échantillons, avec des données associées de qualité, valorisable dans le futur dans le cadre de programmes scientifiques.

L'ensemble des contrôles mis en place tout au long de la constitution de la collection (du prélèvement à la mise à disposition) ont été efficaces, notamment :

  • la bonne information et formation des centres de prélèvements,
  • le recoupement régulier et répété des données enregistrées dans les bases de l'INCa et du CEPH,
  • la traçabilité mise en place par le CRB dès le prélèvement et tout au long du cheminement de l'échantillon (confirmation des doublons attendus, identification de reprélèvements),
  • l'accompagnement du CRB tout au long du projet.

La qualité de l'ADN extrait a conduit à l'obtention d'excellents résultats de génotypage avec 99.5 % des ADN génotypés sur plus de 98 % des marqueurs.

Les publications utilisant les échantillons de la collection
Ferrari A, Vincent-Salomon A, Pivot X, Sertier AS, Thomas E, Tonon L, Boyault S, Mulugeta E, Treilleux I, MacGrogan G, Arnould L, Kielbassa J, Le Texier V, Blanché H, Deleuze JF, Jacquemier J, Mathieu MC, Penault-Llorca F, Bibeau F, Mariani O, Mannina C, Pierga JY, Trédan O, Bachelot T, Bonnefoi H, Romieu G, Fumoleau P, Delaloge S, Rios M, Ferrero JM, Tarpin C, Bouteille C, Calvo F, Gut IG, Gut M, Martin S, Nik-Zainal S, Stratton MR, Pauporté I, Saintigny P, Birnbaum D, Viari A, Thomas G. A whole-genome sequence and transcriptome perspective on HER2-positive breast cancers. Nat Commun. 2016 Jul 13;7:12222. doi: 10.1038/ncomms12222. PMID:27406316

Caractérisation du génome et du transcriptome de 64 tumeurs du sein. Les cancers du sein HER2 ne représentent pas un sous-type intrinsèque mais se retrouvent du phénotype ER+ luminal au phénotype ER- basal avec des altérations du génome correspondant à ces phénotypes.

Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, Martincorena I, Alexandrov LB, Martin S, Wedge DC, Van Loo P, Ju YS, Smid M, Brinkman AB, Morganella S, Aure MR, Lingjærde OC, Langerød A, Ringnér M, Ahn SM, Boyault S, Brock JE, Broeks A, Butler A, Desmedt C, Dirix L, Dronov S, Fatima A, Foekens JA, Gerstung M, Hooijer GK, Jang SJ, Jones DR, Kim HY, King TA, Krishnamurthy S, Lee HJ, Lee JY, Li Y, McLaren S, Menzies A, Mustonen V, O'Meara S, Pauporté I, Pivot X, Purdie CA, Raine K, Ramakrishnan K, Rodríguez-González FG, Romieu G, Sieuwerts AM, Simpson PT, Shepherd R, Stebbings L, Stefansson OA, Teague J, Tommasi S, Treilleux I, Van den Eynden GG, Vermeulen P, Vincent-Salomon A, Yates L, Caldas C, van't Veer L, Tutt A, Knappskog S, Tan BK, Jonkers J, Borg Å, Ueno NT, Sotiriou C, Viari A, Futreal PA, Campbell PJ, Span PN, Van Laere S, Lakhani SR, Eyfjord JE, Thompson AM, Birney E, Stunnenberg HG, van de Vijver MJ, Martens JW, Børresen-Dale AL, Richardson AL, Kong G, Thomas G, Stratton MR. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016 May 2;534(7605):47-54. doi: 10.1038/nature17676.

Séquençage du génome complet de l'ADN issu de 560 tumeurs du sein et des échantillons de sang correspondants. Une grande diversité d'altérations génomiques. Les altérations portent sur 93 gènes parmi lesquels 10 sont altérés de manière récurrente. Cinq nouveaux gènes impliqués dans l'oncogenèse des cancers du sein sont identifiés ou confirmés.

Cox DG, Curtit E, Romieu G, Fumoleau P, Rios M, Bonnefoi H, Bachelot T, Soulié P, Jouannaud C, Bourgeois H, Petit T, Tennevet I, Assouline D, Mathieu MC, Jacquin JP, Lavau-Denes S, Darut-Jouve A, Ferrero JM, Tarpin C, Lévy C, Delecroix V, Trillet-Lenoir V, Cojocarasu O, Meunier J, Pierga JY, Faure-Mercier C, Blanché H, Sahbatou M, Boland A, Bacq D, Besse C, Deleuze JF, Pauporté I, Thomas G, Pivot X. GWAS in the SIGNAL/PHARE clinical cohort restricts the association between the FGFR2 locus and estrogen receptor status to HER2-negative breast cancer patients. Oncotarget. 2016 Oct 14. doi: 10.18632/oncotarget.12669.

Le criblage de l'ensemble du génome de 9500 patientes atteintes de cancer du sein participant à la cohorte SIGNAL/PHARE a permis de restreindre l'association entre le locus FGR2 et le statut de récepteur aux œstrogènes aux seules patientes HER2 négatives.



  
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